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工業(yè)微生物菌種的保藏方法

點擊次數(shù):5250 更新時間:2017-06-05

摘要:菌種是主要的生物資源,一個優(yōu)良的菌種被選育出來以后,必須保持其優(yōu)良性狀不變或盡可能地少變慢變,才不至于降低生產(chǎn)性能,能長期在生產(chǎn)中使用。

本文介紹了常用的微生物菌種的保藏方法:斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、沙土管保藏法、冷凍真空干燥保藏法、液氮超低溫保藏法和基因工程菌的保藏,并比較了它們的優(yōu)缺點。

關鍵詞:微生物;菌種;保藏

菌種是一個國家的重要自然資源,菌種保藏工作是一項重要的微生物學基礎工作,菌種保藏工作者的任務是把從自然界分離得到的野生型或經(jīng)人工選育得到的用于科學研究和工業(yè)生產(chǎn)等方面的優(yōu)良菌種、菌株,用各種適宜的方法妥善保存,使之達到不死、不衰、不變異、不污染,在長時間內保持原有的生產(chǎn)性狀和生命活力,以便于科學研究和生產(chǎn)使用。

1、保藏菌種用培養(yǎng)基

為了有效地保藏微生物菌種,首先需要有良好的培養(yǎng)基。因此,研究選用適宜的培養(yǎng)基是微生物菌種保藏基本的工作。例如,ATCC(美國的一個微生物菌種保藏機構)在1970年以前采用的培養(yǎng)基有498種,1974年有724種,1978年達到1006種,平均每年增加60多種。

2、微生物菌種保藏的基本原理

人們在長時間的工作實踐中,根據(jù)微生物的不同要求,在菌種保藏工作中不斷摸索出各種方法。無論何種保藏方法,主要是根據(jù)微生物生理、生化特點,人工創(chuàng)造條件,使微生物的代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。這些人工造成的環(huán)境主要是低溫、干燥、缺氧三者,此種條件,可使菌株很少發(fā)生突變以達到保持純種的目的。

3、微生物菌種的保藏方法

3.1 斜面低溫保藏法

將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上,待菌充分生長后,棉塞部分用油紙包扎好,移至4~6℃的冰箱中保藏。

保藏時間依微生物的種類而有不同,霉菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2~4個月,移種一次。酵母菌兩個月,細菌每月移種一次。斜面菌種應保藏相繼三代培養(yǎng)物以便對照,防止因意外和污染造成損失。

此法的培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度影響其保藏質量。培養(yǎng)時間過短,保存時容易死亡,培養(yǎng)時間長,生產(chǎn)性能衰退。成熟進行保藏,效果較好。

優(yōu)點是操作簡單,能隨時檢。缺點是容易變異,因為培養(yǎng)基的物理、化學特性不是嚴格恒定的,屢次傳代會使微生物的代謝改變,而影響微生物的性狀;污染雜菌的機會亦較多。

3.2 液體石蠟保藏法

亦稱礦物油保藏法,定期移植保藏法的輔助方法。

(1)液體石蠟的準備:選用化學純液體石蠟,將液體石蠟分裝加塞,用牛皮紙包好,采用以下兩種方式進行滅菌:①121℃濕熱滅菌30min,置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分,經(jīng)無菌檢查后備用。②160℃干熱滅菌2h,冷卻后,經(jīng)無菌檢查后備用。

(2)斜面培養(yǎng)物的制備:將需要保藏的菌種,在適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng),使得到健壯的菌體或孢子。

(3)灌注石蠟:用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟,注入已長好菌的斜面上,其用量以高出斜面頂端1cm為準,使菌種與空氣隔絕。

(4)保藏:將試管直立,置低溫(4~6℃)干燥處或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存保藏2年以上不死,酵母菌可保藏1~2年,一般無芽孢細菌也可保藏1年左右,甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌,在37℃溫箱內,亦可保藏3個月之久。此法的優(yōu)點是制作簡單,不需特殊設備,且不需經(jīng)常移種。缺點是保存時必須直立放置,所占位置較大,同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后,接種環(huán)在火焰上燒灼時,培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺,應特別注意。

3.3 濾紙保藏法

(1)將濾紙剪成0.5cm×1.2cm的小條,裝入0.6cm×8cm的安瓿管中,每管1~2張,塞以棉塞,121℃滅菌30min。

(2)養(yǎng)1~2mL滴加在滅菌培養(yǎng)皿,取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內混勻,制成濃懸液。

(4)用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內,使其吸飽,再放回至安瓿管中,塞上棉塞。

(5)將安瓿管放入內有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中,用真空泵抽氣至干。

(6)將棉花塞入管內,用火焰熔封管口,保存于低溫下。

(7)需要使用菌種,復活培養(yǎng)時,可將安瓿管口在火焰上燒熱,滴一滴冷水在燒熱的部位,使玻璃破裂,再用鑷子敲掉口端的玻璃,待安瓿管開啟后,取出濾紙,放入液體培養(yǎng)基內,置溫箱中培養(yǎng)。

細菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏,前兩者可保藏2年左右,有些絲狀真菌甚至可保藏14~17年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡便,不需要特殊設備。

3.4 沙土保藏法

(1)取河沙加入10%稀鹽酸,加熱煮沸30min,以去除其中的有機質。

(2)倒去酸水,用自來水沖洗至中性。

(3)烘干,用40目篩子過篩,以去掉粗顆粒,備用。

(4)另取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅的時間還要長)。保藏時間2~10年。保藏期間應定期檢查,如培養(yǎng)基露出液面,應及時補充無菌的液體石蠟。

(5)恢復培養(yǎng):恢復培養(yǎng)時,挑取少量菌體轉接在適宜的新鮮培養(yǎng)基上,生長繁殖后,再重新轉接一次。

此法實用而效果好。霉菌、放線菌、芽孢細菌可土,加自來水浸泡洗滌數(shù)次,直至中性。

(5)烘干,碾碎,通過100目篩子過篩,以去除粗顆粒。

(6)按一份黃土、三份沙的比例(或根據(jù)需要而用其他比例,甚至可全部用沙或全部用土)摻合均勻,裝入10mm×100mm的小試管或安瓿管中,每管裝1g左右,塞上棉塞,121℃濕熱滅菌30min,烘干。

(7)進行無菌檢查,每10支沙土管抽一支,將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)48h,若仍有雜菌,則需全部重新滅菌,再作無菌試驗,直至證明無菌,方可備用。

(8)選擇培養(yǎng)成熟的(一般指孢子層生長豐滿的,營養(yǎng)細胞用此法效果不好)優(yōu)良菌種,以無菌水洗下,制成孢子懸液。

(9)每支沙土管中加入約0.5mL(一般以剛剛使沙土潤濕為宜)孢子懸液,以接種針拌勻。

(10)放入真空干燥器內,用真空泵抽干水分,抽干時間越短越好,務使在12h內抽干。

(11)每10支抽取一支,用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒,接種于斜面培養(yǎng)基上,進行培養(yǎng),觀察生長情況和有無雜菌生長,如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長,則說明制作的沙土管有問題,尚須進一步抽樣檢查。

(12)若經(jīng)檢查沒有問題,,箱或室內干燥處保存。情況。

(13)需要使用菌種,,取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內,置溫箱中培養(yǎng)。

此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌、放線菌,因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應用廣,效果亦好,可保存2年左右,但應用于營養(yǎng)細胞效果不佳。

3.5 冷凍真空干燥保藏法

(1)安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時,先用2%鹽酸浸泡過夜,自來水沖洗干凈后,用蒸餾水浸泡至pH中性,干燥后、貼上標簽,標上菌號及時間,加入脫脂棉塞后,121℃下高壓滅菌15~20min,備用。

(2)準備菌種,用冷凍干燥法保藏的菌種,其保藏期可達數(shù)年至十數(shù)年,為了在許多年后不出差錯,故所用菌種要特別注意其純度,即不能有雜菌污染,然后在適培養(yǎng)基中用適溫度培養(yǎng),使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期,若用對數(shù)生長期的菌種進行保藏,其存活率反而降低。一般,細菌要求24~48h的培養(yǎng)物;酵母需培養(yǎng)3d;形成孢子的微生物則宜保存孢子;放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7~10d。

(3)制備菌懸液與分裝以細菌斜面為例,和脫脂牛乳2mL左右加入斜面試管中,制成濃菌液,每支安瓿管分裝0.2mL。

(4)冷凍干燥器有成套的裝置出售,價值昂貴,此處介紹的是簡易方法與裝置,可達到同樣的目的。將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍,無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰(固體CO2)酒精液或干冰丙酮液,溫度可達-70℃。將安瓿管插入冷凍劑,只需冷凍4~5min,即可使懸液結冰。

(5)將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內,開始冷凍干燥,時間一般為8~20h。

(6)將安瓿管頸部用強火焰拉細,然后采用真空泵抽真空,在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。

(7)保藏:安瓿管應低溫避光保藏。

(8)質量檢查:冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查,如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。

(9):酒精棉花擦拭安瓿上部,在頂部,用挫刀或鑷子頸部輕叩一,,用無菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊,使用無菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上,進行適溫培養(yǎng)。

此法為菌種保藏方法中有效的方法之一,對一般生活力強的微生物及其孢子以及無芽孢菌都適用,即使對一些很難保存的致病菌,如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長期保存,一般可保存數(shù)年至十余年,但設備和操作都比較復雜。

3.6 液氮冷凍保藏法

(1)用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管,或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈,121℃下高壓滅菌15~20min,備用。

(2)保護劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護劑時,應注意其濃度,一般采用10%~20%甘油。

(3)微生物不同的生理狀態(tài)對存活率有影響,一般使用靜止期或成熟期培養(yǎng)物。

菌種的準備可采用下列幾種方法:①刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體,與保護劑混勻后加入凍存管內。②接種液體培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與保護劑混合分裝于凍存管內。③將培養(yǎng)物在平皿培養(yǎng),形成菌落后,用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊(直徑約5~10mm),真菌取菌落邊緣的菌塊,與保護劑混勻后加入凍存管內;在小安瓿管中裝1.2~2mL的瓊脂培養(yǎng)基,接種菌種,培養(yǎng)2~10d后,加入保護劑,待保藏。

(4)預凍時一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結到-35℃。

(5)保藏:將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃,液相中溫度為-196℃。

(6)復蘇方法:從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管,應立即放置在38~40℃水浴中快速復蘇并適當搖動。直到內部結冰全部溶解為止,一般約需50~10s。開啟安瓿管或塑料凍存管,將內容物移至適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

此法除適宜于一般微生物的保藏外,對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏,而且性狀不變異。缺點是需要特殊設備。

3.7 基因工程菌的保藏

3.7.1 穿刺保藏法

使用容量為2~3mL并帶有螺口旋蓋和橡皮墊圈的玻璃小瓶,加入相當于約2/3脂,旋上蓋子,但并不擰緊,min。,冷卻至室溫后擰緊蓋子。

保藏細菌時,用一滅菌的接種針挑取良好的單菌落,把針穿過瓊脂直達瓶底數(shù)次,蓋上瓶蓋并擰緊,在瓶身和瓶蓋上均做好標記,室溫下存放于暗處。(更加廣為接受的做法是將瓶蓋放松,在適當溫度下培養(yǎng)過夜,然后擰緊瓶蓋并加封膜,于4℃或于室溫避光保藏。

穿刺法可保藏細菌2年之久。

3.7.2 甘油管冷凍保藏

(1)在液體培養(yǎng)基中生長的細菌培養(yǎng)物的保藏取細菌培養(yǎng)物,加入滅菌甘油(甘油應在1.034×105Pa高壓下蒸汽滅菌20min)振蕩培養(yǎng)物使甘油分布均勻,然后轉移至標記好的、帶有螺口和空氣密封圈的保存管內,在乙醇-干冰或液氮中凍結后轉至-70℃長期保存。復蘇菌種時,用滅菌的接種針刮拭凍結的培養(yǎng)物表面,然后立即把粘附在接種針上的細菌劃于含適當抗生素的LB瓊脂平板表面,凍干保存的菌種管重置于-70℃,而瓊脂平板于37℃培養(yǎng)過夜。

(2)在瓊脂平板上生長的細菌培養(yǎng)物的保存

從瓊脂平板表面刮下細菌放入裝有2mLLB的無菌試管內,再加入等量的含有30%滅菌甘油的LB培養(yǎng)基,振蕩混合物使甘油*分布均勻后,分裝于帶有螺口蓋和空氣密封圈的無菌試管中,按上述方法冰凍保存。

甘油管冷凍保藏法可保藏10年以上,若實驗室不具備-70℃冰箱,也可把菌種放入-20℃冰箱中保藏,可保藏1年左右。

4、 總結

是每株菌種都采用兩種以上的保藏方法,并根據(jù)保藏菌種的保質期,每隔一定時間,進行入藏菌種的復活檢驗和更新。

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